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質粒提取的原理與常見問題

發布者:莊盟生物發布時間:2015-03-09浏覽次數:5243次
質粒提取原理及常見問題解析
目前,已發現有質粒的細菌有幾百種,已知的絕大多數的細菌質粒都是共價閉合環狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細菌質粒的相對分子質量一般較小,約為細菌染色體的0.5%~3%。根據相對分子質量的大小,大緻上可以把質粒分成大小兩類:較大一類的相對分子質量是40×106以上,較小一類的相對分子質量是10×106以下(少數質粒的相對分子質量介于兩者之間)。每個細胞中的質粒數主要決定于質粒本身的複制特性。按照複制性質,可以把質粒分為兩類:一類是嚴緊型質粒,當細胞染色體複制一次時,質粒也複制一次,每個細胞内隻有1~2個質粒;另一類是松弛型質粒,當染色體複制停止後仍然能繼續複制,每一個細胞内一般有20個左右質粒。這些質粒的複制是在寄主細胞的松弛控制之下的,每個細胞中含有10-200份拷貝,如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質的合成還會使質粒拷貝數增至幾千份。


質粒提取原理

現在較常用的質粒提取方法有三種:堿裂解法、煮沸法和去污劑裂解法,前兩種方法較為劇烈,适用于較小的質粒(<15Kb),而去污劑裂解法則比較溫合,一般用于分子量較大的質粒(>15Kb)。

堿裂解法是一種最廣泛使用的制備質粒DNA的方法。其原理為:染色體DNA遠遠大于質粒DNA,染色體DNA為線狀分子,而質粒為共價閉合環狀分子。當pH 12.0-12.6堿性環境中,線性的大分子的染色體DNA完全變性,而共價閉環質粒DNA在将PH調至中性後即可以恢複其天然構象,在高鹽濃度存在的條件下,染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉澱,而質粒DNA仍為可溶狀态,通過離心可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質,質粒DNA仍在上清中。


質粒提取常見問題分析

1、影響質粒提取的因素有哪些?
質粒提取的得率和質量與很多因素有關,如宿主菌的種類和培養條件、細菌細胞的裂解、質粒拷貝數、質粒的穩定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟練程度等等。
2、為什麼從革蘭氏陽性菌中提取質粒要在懸浮液中加入溶菌酶?
革蘭氏陽性菌有一層細胞壁,必須加入溶菌酶才能使之溶解。
3、如何根據實驗需要選擇不同級别的産品?
從純度上:各種常規操作,包括酶切、PCR、測序、文庫篩選、連接和轉化,普通純度的質粒可以滿足要求;而對于轉染實驗,則要求使用高純度質粒提取試劑盒方能滿足要求。
從提取的量上:1-20μg,應選擇小量提取試劑盒;20-40μg,應選擇中量提取試劑盒;大于40μg,應選擇大量提取試劑盒。
從宿主菌上:分為普通細菌質粒提取試劑盒、G+菌質粒提取試劑盒和酵母菌質粒提取試劑盒,根據情況進行選擇。
未提出質粒或質粒得率較低:
△ 大腸杆菌老化  
    請塗布平闆培養後,重新挑選新菌落進行液體培養。
△ 質粒拷貝數低  
由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低,可更換具有相同功能的高拷貝數載體。
△ 菌體中無質粒  
    有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在,經多次轉接後有可能造成質粒丢失。
    例如,柯斯質粒在大腸杆菌中長期保存不穩定,因此不要頻繁轉接,每次接種時應接種單菌落。另外,檢查篩選用抗生素使用濃度是否正确。
△ 堿裂解不充分  
    使用過多菌體培養液,會導緻菌體裂解不充分,可減少菌體用量或增加溶液1、2和3的用量。對低拷貝數質粒,提取時,可加倍使用溶液1、2和3,可能有助于增加質粒提取量和質粒質量。
△ 溶液使用不當
    溶液2、3在溫度較低時可能出現渾濁,應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液,才能使用。
△ 吸附柱過載
   不同産品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的質粒量很大,請分多次提取。若用富集培養基,例如TB 或2×YT,菌液體積必須減少;若質粒或宿主菌是非常高的拷貝數或生長率,則需調整LB培養液體積。
△ 質粒未全部溶解(尤其質粒較大時)
    洗脫溶解質粒時,可适當加溫或延長溶解時間。
△ 乙醇殘留
    漂洗液洗滌後應離心盡量去除殘留液體,樹脂型試劑盒漂洗後應晾幹樹脂,再加入洗脫緩沖液。
△ 洗脫液加入位置不正确
   洗脫液應加在矽膠膜中心部位以确保洗脫液會完全覆蓋矽膠膜的表面達到最大洗脫效率。
△ 洗脫液不合适
    DNA隻在适當pH值的低鹽溶液中才能被洗脫,如洗脫緩沖液TE (10 mM Tris·Cl, pH 8.5)或水;洗脫效率取決于pH值。最大洗脫效率在pH 7.08.5間。當用水洗脫時确保其pH值在此範圍内,如果pH過低可能導緻洗脫量低。洗脫時将滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃後使更用有利于提高洗脫效率。
△ 洗脫體積太小
    洗脫體積對回收率有一定影響。随着洗脫體積的增大回收率增高,但産品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
△ 洗脫時間過短
    洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置一分鐘可達到較好的效果。
質粒質量不高:
△ 混有蛋白
    不要使用過多菌體。溶液1、2、3處理并離心後溶液應為澄清的,如果還混有微小蛋白懸浮物,可再次離心去除後再進行下一步驟。
△ 混有RNA
    RNase A處理不徹底,請減少菌體用量或加入溶液3之後室溫放置一段時間。如果溶液1已保存6個月以上,請在溶液1中添加RNase A。
△ 混有基因組DNA
   加入溶液2和3後應溫和混勻,如果劇烈振蕩,可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質粒中。如果加入溶液2後過于粘稠,無法溫和混勻,請減少菌體用量。細菌培養時間過長會導緻細胞和DNA的降解,不要超過16小時。
△溶液3加入時間過長
    溶液3加入後,放置時間不要太長,否則有可能會産生小片段DNA污染。
△ 含大量核酸酶的宿主菌
    宿主菌含大量核酸酶,在質粒提取過程中降解質粒DNA,影響提取質粒DNA的完整性,最好選用不含核酸酶的大腸杆菌宿主菌,如DH5α和Top10。
△ 裂解時間過長
    加入溶液2後裂解時間不應超過5分鐘。
△ 質粒的二聚體和多聚體形式
質粒複制過程中形成的,與宿主菌相關,電泳可檢測出。